Western blot (immunoblotting) 개인 취향에 대해서. 210530

 

2021.05.29 - [신경과학] - genotyping (유전형 분석) 개인 취향에 대해서. 210529

genotyping (유전형 분석) 개인 취향에 대해서. 210529

 

이번에는 IHC, genotyping 취향에 이어서 역시 어느 실험실이나 빈번하게 사용하는 Western blot (immunoblot)의 개인 취향에 대해서 적어보고 싶다. 

역시 어느 방법을 사용해도 워킹은 어떻게든 되는 굉장히 일반적이고 누구나 하는 툴이기 때문에 취향이랄 것까지도 없지만 내가 알고 또 배운 경험으로 Western blot의 모든 것은 band가 예쁘게 나오는 것에 집중된다.

예쁘게 나온다는 것은 band가 일자로 고르게 또 정량하기 매우 clear하게 나오는 것을 의미한다. 

요즘은 대부분 whole membrane의 사진을 보관하거나 붙임하는 것이 대세이기 때문에 (raw data로서가 아니라 제시용으로) 누가 봐도 깔끔하고 정확한 결과물이 요구된다. 

 

여담으로 생각해보면, Western blot 자체가 몇십 년이나 거의 변함이 없는 방법으로 이어져오는데 아직도 이 방법 외에 노멀하고 간단한 툴이 없는 것을 보면 아이러니한 감정을 느끼기도 한다.

 

 

먼저, Western 방법으로서 나는 wet 방법을 선호한다. 

Semi-dry는 편하지만 느낌상 wet 방법이 더 깔끔하게 나오는 것 같다 (느낌적 느낌 😎).

 

보고 싶은 단백질 타겟 중에 phospho-가 있다면 시료들을 항상 on-ice 에서 위치시키고,

스피디하게 모든 작업을 진행해야 한다. 

사실, 이건 Western 작업보다는 sample을 taking할 때 (homogenize) 매우 빠르게 진행해야 한다.

membrane receptor나 phospho-붙은 단백질은 초보라면 사실 잘 안 될 것이다.

 

정량 방법은 요즘은 엄청 간단하게 기계를 사용해서 한다고 들었는데, 나는 계속 modified Lowry법을 사용해왔기 때문에 다른 방법은 잘 모르겠다. 아무거나 정량만 하면 될 듯. 

사실, Western이라는 방법 상 이 단계가 매우 중요하긴 하다 😅

 

깨끗하고 일자로 된 band를 위해서, gel을 만들고 tank에 위치시킨 후 syringe needle로 well을 청소해주는 것이 좋다고 들었다. 또, running하기 전에 전선 부분에 붙어 있는 버블들을 needle로 제거시켜주는 게 좋다.

그리고, dummy를 사용해서 well의 모든 부분을 채워주는 것이 좋다. 그래야 어느 한 부분이 더 치우치거나 하지 않는다.

 

gel running은 constant Ampere로, transfer는 constant Voltage로 해왔다.

 

wet 방법 기준으로, transfer 단계에서 탱크에 샌드위치 카세트를 넣을 텐데

카세트를 만들 때, 반찬통 같은 박스 안에서 buffer solution을 채워 넣고 만들면 버블이 생기지 않는다.

이때, 나는 buffer solution도 차갑게 한 상태로 하는 것을 좋아한다.

tank 자체도 큰 박스에 ice를 넣어서 그 ice box 자체에 위치시키고 tank 밑부분에는 작은 stirrer를 넣어줘서 tank 안의  buffer도 transfer 동안 차갑게 유지시켜 준다.

 

전사가 끝난 membrane에 항체를 붙일 때, 비닐백을 사용하는 것도 있고 작은 반찬통이나 명함 케이스 같은 플라스틱 케이스 등등 을 사용한다던가 여러 가지 적당한 툴을 사용하면 되지만 경험상 고인물들은 비닐백에 항체랑 membrane을 넣고 sealing을 해서 사용하는 것을 많이 봤다. 

나는 살짝 고무 재질의 케이스를 선호하는데 이유는 씻기 편하고 뚜껑을 닫을 때 sealing이 잘 되는 느낌이 들기 때문이다. 뭘 사용하든 상관없긴 한데, 비닐백을 사용하면 항체 소모율이 매우 낮아진다. 그리고 통이나 케이스를 사용한다면 바닥이 완전 평평한 것을 골라서 쓰면 될 것이다. 

 

항체들을 붙이고 난 후에 washing 과정에서, 특히 2 차 항체 붙일 때는, 핀셋 또는 forcep을 washing 단계마다 바꾸거나 깨끗이 씻어 준 후에 사용해야 좋다. 

 

마지막 단계에서 reagent를 membrane에 발라주고 사진을 찍을 때, 비낼백에 넣어서 골고루 펴준 다음에 사진을 찍는 것이 내 취향이다. 매번 기계 바닥을 닦거나 그럴 필요도 없고, reagent 용액도 잘 spreading되어서 좋다.

 

 

 

+) 210709 추가

 

얼마 전에 굉장히 오랜만에 다시 western blot을 하게 되었는데,

LI-COR 제품으로 blocking solution 및 2nd antibody를 전부 사용했다.

(나는 buffer 종류는 거의 TBS를 선호한다. In vitro work는 PBS를 많이 쓰지만.)

예전에는 running buffer나 transfer buffer도 전부 직접 조제해서 사용했었는데 이번에 할 때는 전부 완제품을 사서 사용했다.

Gel 마저도...ㅎㅎㅎ

 

https://www.licor.com/bio/reagents/intercept-tbs-blocking-buffer

Use Cost-Effective Intercept (TBS) Blocking Buffer

 

https://www.licor.com/bio/reagents/irdye-800cw-goat-anti-mouse-igg-secondary-antibody

IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody

blocking solution (intercept) 직접 사서 해보니 너무 좋고 (일단 편하고, 깔끔한게 느껴짐)

2nd antibody도 붙이고 그냥 washing 몇 번 해주고 바로 reader에서 scan해주면 알록달록하게 밴드가 잘 나온다.

무엇보다 reagent 발라주지 않아도 되는게 너무 편해졌다.

예전의 방법처럼 membrane이 시간지나서 타지도 않고 장시간 보관 가능에 무려 dry 상태로 보관이 가능하다 는 점이...

역시 시간이 갈수록 기술은 발전하고 있다 😎