genotyping (유전형 분석) 개인 취향에 대해서. 210529

2021.05.27 - [신경과학] - IHC (면역조직염색) 개인 취향에 대해서. 210526

IHC (면역조직염색) 개인 취향에 대해서. 210526

 

IHC의 개인 취향에 이어, 실험에서 사용되는 genotyping (유전형 분석)에 대한 '취향'에 대해서 짤막하게 적어보고 싶다. 

 

실험용 동물의 genotyping은 기초적인 루틴으로 많이 하는 작업인데 매우 귀찮은 작업 중에 하나일 것이다. 

최근에는 굉장히 process를 단축시킨 프로토콜이나 방법이 있다고 전해들었는데 찾아보지는 않았다. 

기본적 프로토콜은 랩마다 제각각의 방식으로 운영할 것이지만 내 취향을 적어본다.

 

 

먼저,  실험 동물에서의 조직 채취는 꼬리보다는 toe clipping으로 하는 게 엄청 편하다. 

무엇보다 최근 미국 기준으로는 tail cut하는데에 2 주 이상의 동물에서는 cut하는 것이 추천되지 않거나 금지하도록 되어있다. 

toe clipping하면 좋은 점은, tail cutting보다 감염이나 다른 개체에 의한 상처 부위 biting이 (경험적으로) 적고,

자동적으로 numbering이 되기 때문에 귀에 이상한 태그나 펀칭을 하지 않아도 된다. 펀칭의 경우, 시간이 지나면 구멍끼리 붙거나 너덜너덜해지기 십상이라 나중에 되면 헷갈리는 경우가 종종 생긴다. 

 

랩에 따라서, tissue에서 DNA를 뽑을 때 old한 방식이라면 Tris-HCl과 NaOH 혼합으로 뽑거나 (+ ProK)

DNA purification kit를 사용하여 뽑을 것인데

- GFP, tdTom과 같은 형광 단백질이나

- 특정 부위 specific transgenic이 아닌 전체적 transgenic이라면,

purification kit를 사용할 이유가 없다 고 생각한다 (band는 예쁘게 나올 것이겠지만). 

 

extraction 된 DNA나 뽑기 전 lysis 상태의 tissue를 4 °C에 냉장 보관 안 하고 실온에 몇 달간 나둬도 아무런 문제가 없다. 굳이, 미신처럼 4 °C에 보관하는 경우가 있는데 알다시피 DNA는 상당히 stable한 구조이다. 

 

running gel 만들 때, 1%든 3%든 해보고 band가 잘 뜨는 %를 알아서 커스텀하면 된다. 

매번 칼같이 정량해서 하는 것도 보는 입장에선 상당히 답답한 일이다. 어차피 밴드의 유무를 보는 것이라 %는 큰 의미가 없다.

 

당연한 이야기지만, EtBr보다 SmartGlow를 사용하는 것이 좋다.

 

PCR을 할 때, primer 빼고 나머지 component (Taq 같은거)들은 solution mix로 만들어서 하나의 tube에 통째로 만들어서 쓰면 편하다. primer도 sample DNA와 섞어주기 직전에 solution mix와 섞어서 하나의 master mix로 사용해주면 편하다. 

사실, 한두가지 정도의 gene에 대한 typing만 집중적으로 한다면, primer도 섞어놓고 보관했다가 바로 사용해도 무방하다고 생각한다.

 

genotyping을 처음 하는 target이거나, 처음 실험하는 사람이 아니라면

ladder를 사용할 일이 사실 없다. 

 

PCR 기계에 넣을 때, tube와 plate가 있는데 뭘 사용하든 취향 문제이다. 

다만, 전자동 피펫은 필수품이다. 한 번 사용하면 자동 피펫 없이는 genotyping하기 힘들어진다.

 

genotyping 결과를 가지고 본격적인 실험에 들어가기 전에, 한 번 더 실행하여 double check 하여 confirm을 하는 습관을 가지는 것이 좋을 것 같다.