cDNA growing, extraction & preperation 노트 적기. 210606


언젠가 옛날 옛적에 적어 놨던 노트.
최신은 어떻게 하는지 모르겠다. 이 이후 cDNA로 infection 한 적이 없어서 🤣
노트에 메모하는 성의가 있었던 시기...😎



1. 주문한 cDNA가 오면 (E.coli 상태; 이번 실험의 경우 human pcDNA 3.1 plasmid를 사용함) LB agar plate 상에서 콜로니를 만들어 줘야 함.
- A. LB agar는 agar 분말을 통해서 만들어주며 agar medium에 selection을 위해서 ampicillin을 넣어준다.
- B. 나머지 E.coli 용액은 -80℃에서 storage.


2. E.coli 용액 10 ul 정도를 agar 위에 올려주고 스프레딩 해준다.
- A. 이때, 작업 테이블의 토치를 켜두고 작업하도록 한다.
- B. 스프레딩 기구를 불로 잘 소독하고 다 사용한 후에도 소독하고 정리해 줌.


3. Agar를 incubator에 overnight 배양시켜준다.


4. Agar에 colony가 생겼다면, colony를 픽업해서 3 ml의 LB broth에 넣어준다 (37℃, overnight).
- A. LB broth는 200 ml bottle에 4 g의 broth를 넣어주고 autoclave시켜서 준비한다.


5. 다음날, 3 ml의 증균 LB broth를 200 ml의 LB broth에 넣어서 large preparation해준다 (37℃, overnight).
- A. 200 ml의 broth에도 ampicilin을 넣어준다. 200 ml이므로 200 ul를 넣어줌.
- B. Air circulation을 위해서 cap을 느슨하게 해준다.
- C. 200ml 두 개를 shaker 위에 대각선상으로 놓고 원형 shake를 해줌.


6. 다음날, 플라스크 용액을 큰 원심기용 원통에 넣고 6,000 rpm, 4℃, 10 분 centrifuge 시켜준다 (TA-13).
- A. Rotor code를 check.
- B. 원통의 캡을 tight하게 닫아주고 로터의 red dot을 맞춰준다.
- C. ACC 속도 5, DEC 속도 9 로 해준다.


7. 여기서부터는 QIAGEN Plasmid Maxi kit를 사용하여 kit protocol 대로 행함.
- A. Supernatant를 버리고, Buffer P1 10 ml를 각각의 원통에 남은 pellet에 적용하여 resuspending해줌.
- B. 그 후, Buffer P2를 10 ml 넣어주고 4~6 번 대충 흔들어준다. 5 분간 RT에 방치
- C. Buffer P3을 4~6 번 역시 흔들어주고 ice 위에 20 분 방치한다.
- D. 14,000 rpm, 4℃에 30 분 centrifuge 시켜줌
- E. QIAGEN column 2 개를 Tool에 끼우고 supernatant를 넣어준다. Gravity flow로 column에서 액체가 더 안 떨어질 때까지 기다린다.
- F. Buffer QC를 한 개당 30 ml로 2 번 column을 washing해준다. 역시 Gravity flow로 column에서 액체가 더 안 떨어질 때까지 기다린다.
- G. 50 ml tube를 밑에다가 두고 Buffer QF 15 ml씩을 apply한다.
- H. Isopropanol (2-propanol) 10.5 ml를 apply한 후, 14,000 rpm, 4℃, 60 분 centrifuge 시켜준다.
- I. Supernatant를 버리고 티슈를 깐 후, Pellet을 5~10 분 air dry 해준다. Dry 후, 1 X Tris-EDTA solution을 300 ul 적용한다. 처음엔 볼텍스를 하지 말고 손가락 tapping으로 잘 녹여준다. 그 후 볼텍싱을 하자.
- J. Tube 1.5 ml 8 개를 준비한다. 4 개에는 Phenol-chloroform 300~400 ul을 넣어주고 2 개에는 Chloroform을 준비. 동시에 100%, 70% EtOH 용액을 On ice 상태로 준비한다.
- i. Phenol-chloroform을 분주할 때는 용액의 밑층을 이용한다.
- K. DNA를 녹인 Tris-EDTA solution 300 ul을 14,000 rpm, 25℃, 1 분 centrifuge 시켜준다.
- L. Phenol-chloroform이 들어있는 tube에 각각 supernatant를 넣어준다. 그 후, 15,000 rpm, 25℃, 5 분 centrifuge 시켜준다.
- M. 다시 supernatant만을 또 다른 Phenol-chloroform이 들어있는 tube에 각각 넣어준 후 다시 15,000 rpm, 25℃, 5 분 centrifuge 시켜준다.
- N. 다시 supernatant만을 이번엔 chloroform이 들어있는 tube에 각각 넣어준 후 다시 15,000 rpm, 25℃, 5 분 centrifuge 시켜준다.
- O. 3M sodium acetate (pH5.2) solution을 30 ul (1/10용량)을 각각 apply 해주고 100% EtOH 1000 ul를 각각 넣어준다.
- P. 10분 정도 기다린다. 15,000 rpm, 4℃, 10 분 centrifuge 시켜준다.
- Q. Supernatant를 버리고 70% EtOH 500 ul을 린스하듯이만 apply해주고 다시 15,000 rpm, 4℃, 5 분 centrifuge 시켜준다.
- R. 상층액을 버린 후, 티슈를 깔고 털어준다. 그리고 50 ℃ incubator에 튜브를 넣어주고 10~15 분 동안 dry시킨다. 위에는 랩을 깔아둠.
- S. Dry시킨 후에 Tris-EDTA 200 ul로 희석함.

8. Nanodrop으로 Conc. 체크해 준다. 최종적으로 1 mg/ml의 농도로 되도록 해준다. 200 ul 넣어주면 이번 경우에는 2 mg/ml 정도로 나와서 다시 200 ul을 넣어줘서 1 mg/ml으로 맞춤.

9. Absorption Ratio가 1.8 정도가 ideal하지만 1.4 이상이면 오케이.