세포 노화 (senescence) 유도 protocol. 231105

역시나 문서 정리의 일환으로 cellular senescnece induction에 대해서 노트.

 

유도는 H2O2로 간단하게 in vitro에서 하고,

주로 outcome을 SA-β-gal staining과 WB로 보는 것으로 생각하면 된다 😎

 

• 세포를 1X105 정도 35 mm dish에 깔아주고
• 4 hr 배양
• 200 uM H2O2를 10% FBS DMEM 2 ml로 해서 세포에 2 hr 처리
  • 고농도 처리를 할 경우, 600 uM에 2 hr 처리
  • 처리 시간에 변수를 주고 싶으면, 2 hr/ 4 hr 로 나눠줌

 

• 3일간 24 hr term으로 200 uM H2O2 처리를 해줌
• 1차 sampling

 

• Day 5 시점에 passaging 시켜줌
• 그 후, 다시 3일간 24 hr term으로 200 uM H2O2 처리를 해줌
• 2차 sampling

 

• Day 10 시점에 passaging 시켜줌
• 그 후, 다시 3일간 24 hr term으로 200 uM H2O2 처리를 해줌
• 3차 sampling

 

 

1) SA-β-gal staining은 kit를 쓰면 된다.

https://www.cellsignal.com/products/cellular-assay-kits/senescence-b-galactosidase-staining-kit/9860

 

먼저 staining solution을 제작해야 하는데

예를 들자면, 대충 X-gal을 DMSO에 20 mg/ml로 dissolve 시킨 후 X-gal 50 ul과 staining solution 940 ul, staining supplement 10 ul을 사용해서 만듦.

그 후, 일반적인 cell fixation 후에, solution mix를 1 ml 넣어서 37 °C에 over-night incubation 해주면 끄읕.

 

 

2) WB은 lab 별로 general method 대로 실행하면 될 듯.

 

https://ss-salix.tistory.com/107

 

Western blot (immunoblotting) 개인 취향에 대해서. 210530

 

 

3) 사실, 세포 노화 기전 관련은 nuclear/cytosol faction separation이 중요하니까 WB할 때 nucleus 부분을 잘 따서 하시길 바람.