OPC culture method. 231121

OPC (oligodendrocyte progenitor cells)을 mouse에서 채취해서 실험에 적용할 일은 딱히 없긴 했는데 노트 정리 겸...🤣

이런 류의 방식은 일반적인 primary neuronal culture 방식과 비슷하다.

Neuron은 보통 hippocampus를 떼서 culturing하는 방식이 더 여러모로 써먹기에 좋겠지만 astrocyte, microglia, oligo 등은 cortex를 그냥 써서 사용하면 된다.

 

적기 전 잠깐 검색해보니까 Immunopanning법을 사용한 방법은 아래와 같다

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2215016123000547#:~:text=Cold%20Spring%20Harbor%20protocols%2C%202013(9)%2C%20854%E2%80%93868.%20https://doi.org/10.1101/pdb&text=culture%20and%20induce%20a%20high%20rate%20of%20OPC%20proliferation%20to%20expand%20cultures%20(Fig.

An optimized and validated protocol for the purification of PDGFRα+ oligodendrocyte precursor cells from mouse brain tissue via

 

 

그건 그렇고, 아래의 노트 정리 방법은 굉장히 classic한 그런 방법 🙄

immunopanning법으로 specify하는 부분을 제외하고는 비슷한데

 

방법은

 

먼저 대략 E14-16 사이의 mouse cortex를 떼어내서 37℃ dispase solution에 넣어준다.

한 마리에서 나오는 산자 수를 전부 사용해 주면 될 것이다 (대략 8-9).

이때, MEM (-) 용액에서 on ice 상으로 진행한다.

dura 등과 같은 것은 깔끔히 제거해 주고 hippocampus는 제거해 준다.

조직을 약간 풀어주면서 DNase I solution을 넣어주고 피펫팅을 해준 다음 MEM (+)를 넣어준다.

그리고 필터링을 한 번 해준 다음, 완전히 피펫팅으로 풀어준다.

 

Centrifuge를 해주고, MEM (+)를 채워줘서 10 ml로 맞춘 다음 PDL coated flask에 깔아준다.

하면서 이래저래 cell counting이나 등등 기본적인 것을 진행해 준다.

 

2 일 후에 MEM medium 교환을 해주고, 교환해 줄 때 기존 medium은 centrifuge 해주고 supernatant 부분은 flask에 다시 넣어준다.

 

그리고 다시 3일 후에 flask를 수작업으로 쉐이킹해준다.

이건 전통적 방법이라 하는 사람마다 좀 상이한데, 몇 분 정도 수평방향으로 좀 강렬하게 흔들어 준 다음, 위와 같이 또 medium 교환 작업을 진행한다.

그 후, shaker에 overnight으로 올려놓는다.

 

다음 날, flask의 supernatant 부분을 필터링해주고 일반 dish에 넣어준다. 그 후, 30 분 정도 배양해 주고 적절한 tube에 옮긴 후에 피펫팅 해준 다음 다시 필터링을 해준다.

Centrifuge를 해준 후에

OPC culture medium을 사용하여 (아래 링크 참조) PDL coated dish에 cell을 깔아준다.

 

https://cshprotocols.cshlp.org/content/2013/8/pdb.rec075549.short

OPC Culture Medium

 

사실, 배지를 뭘 하느냐 가 이러한 cell type 별 culturing의 거의 핵심이긴 한데,

OPC는 위의 링크에서 적어놓은 것처럼, DMEM-Sato base에 T3, T4를 빼준 recipe medium을 사용해 주면 된다.

아니면, 맨 위의 참고 논문에 나온 recipe처럼

Insulin, Sato supplement, Forskolin, Biotin, bFGF, PDGF 가 들어간 medium을 사용한다.

 

중간에 배지는 한 번 교환해 주고, P1을 만들고 5-6 일 정도 후에 passaging을 시켜준다.

confluence에 따라서 neuron/OPC ratio가 좀 차이 날 수 있긴 하므로 몇 번 시행착오를 하고 최적화 시키면 될 듯.

이러면 대충 2주일 정도 걸리는 타임라인이 나온다.

PDL coated dish는 그냥 사서 쓰면 된다.